基因編碼的熒光傳感器可以在單細(xì)胞水平追蹤代謝物、蛋白質(zhì)或重金屬離子等細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的豐度變化和動(dòng)力學(xué)分布，并解析活細(xì)胞的生理過程和信號(hào)傳導(dǎo)通路。7月24日，《核酸研究》（Nucleic Acids Research）在線發(fā)表了中國科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院李幸團(tuán)隊(duì)撰寫的題為Genetically encoded RNA-based sensors with Pepper fluorogenic aptamer的研究論文。該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一類基因編碼的新型熒光RNA傳感器。該傳感器能夠在活細(xì)胞中監(jiān)測(cè)代謝物、外源藥物、蛋白與金屬離子等靶標(biāo)，展現(xiàn)出高通量、高內(nèi)涵藥物篩選的潛力。
傳統(tǒng)的基因編碼傳感器由熒光蛋白和結(jié)合靶標(biāo)的蛋白模塊組成。然而，由于多數(shù)靶標(biāo)缺乏對(duì)應(yīng)的蛋白模塊，科學(xué)家難以構(gòu)建基于熒光蛋白的傳感器。此外，基于熒光蛋白的傳感器還有信噪比低等缺陷，限制了熒光蛋白傳感器的應(yīng)用。
近年來，基于熒光RNA的傳感器發(fā)展迅速。熒光RNA傳感器由熒光RNA與結(jié)合靶標(biāo)的RNA模塊組成。二者通過一個(gè)短莖連接。該短莖稱為傳導(dǎo)模塊（transducer module），其熱力學(xué)穩(wěn)定性由靶標(biāo)識(shí)別適配體調(diào)節(jié)。靶標(biāo)與結(jié)合靶標(biāo)的RNA模塊結(jié)合，誘導(dǎo)RNA構(gòu)象變化，調(diào)控?zé)晒釸NA適配體的熒光強(qiáng)度，從而檢測(cè)靶標(biāo)信號(hào)，解析其在活細(xì)胞中的信號(hào)通路。然而，這些熒光RNA傳感器通常含有RNA G四鏈體（RG4）結(jié)構(gòu)。RG4結(jié)構(gòu)可被活細(xì)胞解旋酶靶向，導(dǎo)致RNA的解旋或降解，故限制了含RG4的熒光RNA傳感器在活細(xì)胞中的應(yīng)用。
為此，李幸團(tuán)隊(duì)通過系列實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研發(fā)了不包括RG4的熒光RNA傳感器。研究選擇使用了Pepper熒光適配體。Pepper不含RG4結(jié)構(gòu)，避免了被細(xì)胞酶降解或解旋。此外，Pepper亮度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，并能夠結(jié)合不同小分子探針產(chǎn)生不同顏色的熒光?；诖耍钚覉F(tuán)隊(duì)開發(fā)了一系列基于Pepper的生物傳感器。進(jìn)一步，實(shí)驗(yàn)表明這些傳感器不包含RG4結(jié)構(gòu)，并可以高效監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的內(nèi)源小分子代謝物、外源藥物、蛋白質(zhì)和金屬離子等多種靶標(biāo)。該研究發(fā)展的基于RNA傳感器率先用于檢測(cè)人體細(xì)胞內(nèi)的金屬離子，為探索人體活細(xì)胞金屬離子提供了新型基因編碼工具（圖1）。
該團(tuán)隊(duì)基于Pepper的生物傳感器，探討了甲基化代謝物S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）代謝通路，測(cè)定了靶標(biāo)藥物活性。研究將Pepper與SAM適配體融合，構(gòu)建出低背景、高響應(yīng)、高選擇性的SAM傳感器。進(jìn)一步，該工作探究了單細(xì)胞中SAM合成的代謝來源，解析了SAM合成酶（methionine adenosyltransferase，MATase）的酶活性和基因表達(dá)水平。此外，該工作還構(gòu)建了監(jiān)測(cè)SAM的比率傳感器。該傳感器精確定量了MATase的酶活性，并準(zhǔn)確測(cè)定了MATase抑制劑AG-270的半抑制濃度（IC50）。該工作首次發(fā)展熒光RNA傳感器來準(zhǔn)確測(cè)定活細(xì)胞中的藥物IC50，為研發(fā)基于RNA的藥物篩選平臺(tái)驗(yàn)證了可行性，并提供了高效的MATase酶藥物篩選工具（圖2）。
該團(tuán)隊(duì)為追蹤活細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑提供了高效的生物傳感平臺(tái)，在藥物篩選和疾病診斷等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。研究工作得到國家自然科學(xué)基金等的支持。
論文鏈接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkad620/7230091?login=false
圖1.?將Pepper改造為高性能熒光RNA傳感器，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)，監(jiān)測(cè)細(xì)胞甲基化代謝通路與藥物活性
圖2.?構(gòu)建基于Pepper的比率傳感器，準(zhǔn)確測(cè)定MATase抑制劑AG-270的半抑制濃度（IC50）
