配制好的流動相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來過濾。這是因為溶液中含有很多肉眼難以發(fā)現(xiàn)的微小顆粒，如果不把它們?yōu)V除掉，就會堵塞泵口、柱頭上的過濾器，這樣就堵塞了流動相的正常通道，使色譜柱的阻力增加，柱壓升高，柱效下降。碰到這種情況時，要換用經(jīng)過濾的流動相，并將堵塞的濾器拆下來浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機清洗20分鐘，以除去濾片上的堵塞物。
2、流動相的脫氣
流動相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動相中的氣體，否則，這些氣體會使柱填料的性能降低，還能夠?qū)z測器的信號產(chǎn)生很大的干擾。脫氣有多種方法，如超聲脫氣、真空脫氣、氮氣脫氣等。真空脫氣法和氮氣流脫氣法是目前最常用的脫氣法。水和甲醇混合后會產(chǎn)生大量的氣泡，如果不脫氣就使用，氣泡就會進入色譜柱和檢測器，并將影響分析工作的正常進行。
四、色譜柱的使用和保養(yǎng)
色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件，被測物質(zhì)能否被很好的分離和測定，色譜柱的性能起著決定性的作用。因此，在日常工作中，應特別注意色譜柱的正確使用和維修保養(yǎng)，以延長色譜柱的使用壽命。
1、使用預柱和保護柱
預柱(pre-column)安裝于泵和進樣器之間，它給色譜柱中的流動相提供了完全的平衡，并防止了對柱填料有破壞作用的組分或污染物進入色譜柱。保護柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進入色譜柱，保護柱應與色譜柱的填料相同。預柱和保護柱可以經(jīng)常更換，而不需要經(jīng)常更換色譜柱，這就延長了色譜柱的使用壽命。
2、防止氣體進入色譜柱
有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進入的，否則將會使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室。因此，為了防止氣泡進入色譜柱，一定要使用經(jīng)過脫氣的流動相，并且要嚴格按照下列步驟來安裝色譜柱：
a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲，觀察是否有溶劑滲出；
b.如有溶劑滲出，即可將色譜柱接到管路上，以避免氣泡的進入；
c.如無溶劑滲出時，表明色譜柱的此端已經(jīng)進去空氣了，此時，可將色譜柱的出口端接到進樣閥上，以流動相來反方向沖洗色譜柱，以便將柱內(nèi)的空氣排除。最好以0.2ml/min的小流量來沖色譜柱，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會導致柱性能的降低；
d.如果流出的溶劑里不含有氣泡，說明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了，再將色譜柱以正確的方向接好，這樣氣泡就進不到色譜柱里面了。
3、色譜柱的清洗
凝膠濾過色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動相，用完之后當然要用蒸餾水來沖洗。如果是連續(xù)操作，可以將緩沖溶液置于柱內(nèi)過夜，但最好是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對柱體的腐蝕。
4、色譜柱的存放
如果色譜柱暫時不用，存放時要注意以下幾點：
a.幾天之內(nèi)的短期放置，應先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來沖洗)，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。
b.如果色譜柱長期不用，僅用上述方法來處理就不行了，這時應使用色譜柱使用說明書中所指明的溶劑來充滿色譜柱，反相柱一般使用甲醇，正相柱則可用正已烷或庚烷，而凝膠柱則不能用水了，因柱內(nèi)如果有微生物的生長則會使柱效降低，此時應用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來沖洗色譜柱，再將色譜柱封嚴。色譜柱長期放置時，一定要將色譜柱的兩端封嚴，以防止由于溶劑揮發(fā)而造成的柱填料干縮現(xiàn)象，因這可導致柱效的嚴重降低。
c.色譜柱應貯存在室溫下，如果放置于0℃以下的環(huán)境里，柱內(nèi)就會結(jié)冰，這也將導致柱效的降低。
五、色譜峰的雙峰問題
長期使用后的色譜柱，如果有雜質(zhì)進入，就會使色譜柱入口處的固定相“板結(jié)”并在流動相所產(chǎn)生的高壓作用下，形成柱頭的塌陷，被分析的樣品組分的正常色譜峰就變成了雙峰，這時可按下述方法來修復色譜柱。首先將柱頭的緊固螺母旋下，這時就會發(fā)現(xiàn)柱頭內(nèi)的固定相已被壓縮進去了，嚴重時可縮進10mm以上。在這種情況下，我們可用針尖將流動相表層板結(jié)變黃的部分摳掉，并以相同的固定相將此塌陷區(qū)填平、壓實，再將色譜柱的緊固螺絲上緊，修復工作即告結(jié)束。用經(jīng)過修復后的色譜柱再做樣品時，色譜峰就恢復正常了。
