定量指的是待分析物的含量質(zhì)譜可以通過分子量信息定性(結(jié)構(gòu))。
1、質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度與待分析物含量的關(guān)系
任何定量分析方法都需要建立實(shí)驗(yàn)測(cè)量信號(hào)與待分析物的量的關(guān)系。很幸運(yùn)的是,在質(zhì)譜中,通常也可以建立這樣的關(guān)系,因此質(zhì)譜信號(hào)是可以用于定量的。
既然問題是“質(zhì)譜是怎樣做到定量的?”,我們不妨把質(zhì)譜信號(hào)的產(chǎn)生按時(shí)間順序粗略分為三個(gè)步驟,即離子的產(chǎn)生,傳輸與檢測(cè)。
產(chǎn)生離子時(shí),不同樣品分子的電離通常是相互獨(dú)立的。因此樣品量越多,其產(chǎn)生的離子也就越多。目前常用的各種離子化方法(EI、ICP、ESI、MALDI等)在實(shí)驗(yàn)中(嚴(yán)格來說僅在一定濃度范圍內(nèi)——術(shù)語是動(dòng)態(tài)范圍,dynamic range)都至少滿足樣品量與產(chǎn)生離子量的正相關(guān),一般情況下也可以進(jìn)一步近似成線性相關(guān)。
傳輸離子時(shí),簡(jiǎn)單來說可以認(rèn)為傳輸效率與被傳輸離子的量無關(guān);(嚴(yán)格地說,被傳輸?shù)碾x子太多時(shí),相同電荷的互相排斥會(huì)造成離子束的“體積”變大,導(dǎo)致傳輸效率下降。這種影響在空間有限的離子阱中表現(xiàn)得更加明顯,因此在離子阱質(zhì)譜中一個(gè)重要的技術(shù)就是適當(dāng)控制進(jìn)入儀器的離子數(shù)量,使其既不太少也不太多。)
檢測(cè)離子時(shí),不論是使用光電倍增管的檢測(cè)器,還是檢測(cè)鏡像電流的檢測(cè)器(ICR/Oribtrap),其信號(hào)強(qiáng)度(在一定范圍內(nèi))均與離子數(shù)量大致線性相關(guān)。
我們看到的質(zhì)譜圖常用相對(duì)強(qiáng)度作為縱坐標(biāo),即0-100%最強(qiáng)峰,而不展示信號(hào)的絕對(duì)強(qiáng)度。但在做質(zhì)譜的時(shí)候,儀器記錄的當(dāng)然是絕對(duì)強(qiáng)度(相對(duì)強(qiáng)度也是通過絕對(duì)強(qiáng)度換算出來的)。我們需要用絕對(duì)強(qiáng)度來定量時(shí),就需要這部分平時(shí)不??吹男畔⒘?。
另外,在談到色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法時(shí),待分析物與實(shí)驗(yàn)測(cè)量信號(hào)的關(guān)系之中又多了一層色譜,即待分析物含量->色譜流出物中樣品含量->質(zhì)譜信號(hào)。與EI譜圖分析以相對(duì)強(qiáng)度為主不同,在色譜-質(zhì)譜聯(lián)用時(shí),信號(hào)的絕對(duì)強(qiáng)度就成了我們天天都要關(guān)心的內(nèi)容,因?yàn)橘|(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間的變化就是實(shí)驗(yàn)的色譜圖,通常以總離子強(qiáng)度或者某一特定質(zhì)荷比離子的強(qiáng)度作圖。
說過了為什么質(zhì)譜可以定量,下面我們來看看具體的定量方法。常用的定量方法有兩種,外標(biāo)法與內(nèi)標(biāo)法。
外標(biāo)法
用已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品A和未知量的待測(cè)樣品A分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn);我們會(huì)得到以下三個(gè)信息:標(biāo)準(zhǔn)樣品的量(已知);標(biāo)準(zhǔn)樣品的信號(hào)強(qiáng)度;待測(cè)樣品的信號(hào)強(qiáng)度。(假設(shè)樣品的響應(yīng)=常數(shù)*濃度,從這三個(gè)信息即可算出待測(cè)樣品的量。)
為了更加精確地測(cè)定未知量的樣品,我們希望標(biāo)準(zhǔn)樣品的信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)樣品的信號(hào)強(qiáng)度盡量接近(以減少非線性響應(yīng)的影響)。因此常用的外標(biāo)法會(huì)測(cè)量一系列已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品,繪制一條工作曲線,再用擬合的方法確定未知樣的量。