作為極具前景的治 療藥物，寡核苷酸已成為全 球研發(fā)和投資的重 點領(lǐng)域。寡核苷酸受到合成反應(yīng)效率和原料純度等多重因素的影響，在合成過程中會產(chǎn)生多種不同的雜質(zhì)。反相色譜、離子交換等是對寡核苷酸粗品純化的常用色譜手段。

寡核苷酸純化工藝，需要充分考慮產(chǎn)品純度和回收率之前的平衡，有效的純化放大策略有利于工藝開發(fā)和制備放大的順利進行。下圖 1 展示了典型純化工作流程。

圖 1. 采用安捷倫自動純化軟件實現(xiàn)自動化純化工作流程

安捷倫針對寡核苷酸制備，主要工作流程包括：

1、在分析柱上，進行目標化合物確認和分析方法篩選；

2、將分析數(shù)據(jù)導入到自動純化軟件中，指定目標化合物并生成“聚焦”制備梯度；

3、在制備柱上進行純化；

4、自動純化軟件將需要分析的餾分自動生成序列表，以進行餾分分析和純度確認。

寡核苷酸分析到純化實例

本實例采用了安捷倫 1290 Infinity II 自動放大 LC/MSD 系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有以下特性：

圖 2. 安捷倫 1290 Infinity II 自動放大 LC/MSD 系統(tǒng)

（點擊圖片查看產(chǎn)品詳情）

• 在一套系統(tǒng)上實現(xiàn)從分析到制備的放大，提高制備通量

• 自動餾分延遲傳感器技術(shù)，以及極低的峰擴散和交叉污染，提高餾分的純度和回收率

• 自動純化軟件使工作流程能夠從分析自動放大至制備，無需進行方法開發(fā)

對于寡核苷酸純化，安捷倫 AdvanceBio 寡核苷酸系列色譜柱是首 選。這類柱子使用了 Agilent InfinityLab Poroshell 技術(shù)，并且鍵合了高 pH（HPH）鍵合相。不僅能在較高 pH 和溫度下使用，每批 AdvanceBio 寡核苷酸色譜柱還會進行嚴格質(zhì)量控制，以實現(xiàn) n/ (n–1) 寡核苷酸分離。本實例使用色譜柱：

分析柱

Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18, 3 × 100 mm，2.7 μm（貨號 695975-502）

制備柱

Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色譜柱，21.2 × 150 mm，4 μm（貨號 671150-702）

本實例樣品

濃度 3.1 mmol/L，溶于 20 mmol/L PBS 中的寡核苷酸樣品。

本實例工作流程

1、在分析柱上，進行目標化合物確認和分析方法篩選

表 1. 分析運行的色譜條件，HA/HFIP 法

使用 HPLC/MS 方法（HA /HFIP，二乙胺/六氟異丙醇，見表 1）分析樣品（見圖 3）。

圖 3. 使用 HA/HFIP 和優(yōu)化的梯度分離樣品

根據(jù)分析結(jié)果提取質(zhì)譜圖，確定寡核苷酸分子量 10704Da。利用 OpenLab ChemStation 中的解卷積工具計算分子量，將信號與電荷數(shù)關(guān)聯(lián)（圖 4）。在制備時多電荷離子可用來觸發(fā)餾分收集。

圖 4. 通過解卷積計算寡核苷酸分子量和多電荷離子（A：電荷數(shù)）

考慮到制備在高流速運行下的溶劑成本，開發(fā)了一個不需要用到 HFIP 這類價格較高溶劑的方法（DBA-TRIS，二丁胺-TRIS），見表 2。

表 2. 分析和制備運行的色譜條件, DBA-TRIS 法

用 DBA/TRIS 分離的分析圖譜見圖 5。

圖 5. 使用 DBA/TRIS 和通用梯度分離寡核苷酸

2、將分析數(shù)據(jù)導入到自動純化軟件中，指定目標化合物，自動生成制備聚焦梯度

將分析數(shù)據(jù)導入自動純化軟件中，點擊設(shè)定目標峰，自動純化軟件就能自動生成制備聚焦梯度，見圖 6。

圖 6. 為寡核苷酸計算制備聚焦梯度

3、在制備柱上進行純化

定義觸發(fā)餾分收集的目標質(zhì)量數(shù)，用聚焦梯度進行純化。圖 7 顯示了制備分離和餾分收集的情況，共收集了八個餾分片段。

圖 7. 使用 DBA/TRIS 和聚焦梯度對寡核苷酸進行制備純化

4、通過自動純化軟件餾分導出工具，將需要分析的餾分生成序列表進行分析

圖 8. 寡核苷酸純化收集的八個餾分分析的色譜圖疊加

餾分再分析的結(jié)果見圖 8。第 一個餾分（藍色標記）含雜質(zhì)，其余所有餾分純度均 >99%。質(zhì)譜觸發(fā)的選擇性收集，使得餾分純度更高。