研究背景與成果

生物分子的結(jié)構(gòu)解析與相關生物學功能的關聯(lián)研究已成為現(xiàn)今生命科學的前沿。生物分子存在多級結(jié)構(gòu)，而其結(jié)構(gòu)復雜度的一個重要因素為分子異構(gòu)。不同的異構(gòu)分子（Isomers and isoforms）具有相同的化學式和分子量，但化學結(jié)構(gòu)不同。例如，單糖存在多種異構(gòu)體，包括葡萄糖、果糖、半乳糖等；多糖由單糖兩兩通過糖苷鍵相互連接組成，導致出現(xiàn)更為復雜的構(gòu)造異構(gòu)（分子中原子或原子團互相連接次序不同，Structural or constitutional isomers）和立體異構(gòu)現(xiàn)象（連 接 次 序 相 同 但 空 間 排 列 不 同，Spatial isomers or stereoisomers）。

離子遷移（Ion mobility, IM）與質(zhì)譜（Mass spectrometry, MS）聯(lián)用（IM-MS）分析已經(jīng)發(fā)展為生物分子特別是生物大分子結(jié)構(gòu)解析的一種主要手段，并成為質(zhì)譜儀器發(fā)展的主要方向。IM可以區(qū)分MS不能區(qū)分的異構(gòu)體或同重素（Isobars），這一獨到的特性對生物分子的結(jié)構(gòu)解析研究十分關鍵，近年來被廣泛用于糖結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性、蛋白質(zhì)-分子相互作用等研究中。近年來，多種IM 分析方法被紛紛提出，例如遷移時間 DTIMS （Drift time ion mobility spectrometry）、囚禁式 TIMS（Trapped ion mobility spectrometry）、行波 TWIMS（Travelling wave ion mobility spectrometry） 以及非對稱場 FAIMS（Field asymmetric ion mobility spectrometry）等。然而，這些技術均基于低E/N場原理（E/N < 30 Td，E代表電場場強，N代表中性氣體數(shù)密度，Td是Townsend數(shù)），分離分辨率一般在40-200，不足以解決目前生物分子異構(gòu)體解析研究的迫切需求。

圖1. 離子云掃描分析技術的儀器設置、原理和性能表征。（a）Mini β質(zhì)譜儀器系統(tǒng)。（b）實驗裝置示意圖。（c）離子云掃描技術原理。強迫振動下的兩種異構(gòu)體離子（紫色和藍色）的離子軌跡。（d）獲得的離子云掃描譜圖。

針對以上難題，清華大學精密儀器系生物醫(yī)學儀器與應用研究團隊向高E/N場尋求突破離子遷移分析低分辨率的局限，提出一種超高場離子云掃描技術，并在Mini β質(zhì)譜儀器系統(tǒng)（PURSPEC科技(北京)有限公司）上實現(xiàn)遷移分辨率超過10,000的高分辨IM分析，提升較現(xiàn)有技術水平一個數(shù)量級以上（圖1）。超高場離子云掃描技術采用強迫振蕩的物理原理，在超高場（約1×105 Td）條件下實現(xiàn)異構(gòu)體離子的離子云分離，通過掃描激發(fā)振蕩電壓可以獲得異構(gòu)體離子的高分辨IM譜圖。

成果優(yōu)勢

利用高場離子云掃描分析技術，對四種二糖異構(gòu)體 （海藻糖、麥芽糖、纖維二糖和乳糖，圖2a）開展了結(jié)構(gòu)分析（圖2b），并對乳糖和纖維二糖的混合物進行了離子云掃描分析（圖2c），并與傳統(tǒng)串聯(lián)質(zhì)譜分析（圖2d）結(jié)果對比。從圖2d可見，乳糖和纖維二糖具有到相同的碎裂模式，無法通過串聯(lián)質(zhì)譜技術加以區(qū)分。但這兩種異構(gòu)體可以通過離子云掃描實現(xiàn)完全分離（圖2c）。此外，離子云掃描分析技術也展現(xiàn)出優(yōu)異的定量分析特性（圖2e和2f）。

圖2. 二糖異構(gòu)體分析。（a）四種二糖異構(gòu)體及其（b）離子云掃描譜圖。乳糖和纖維二糖混合物的（c）離子云掃描譜圖和（d）串級質(zhì)譜分析譜圖。（e）兩種二糖標準品及（f）混合物的定量分析結(jié)果。

離子云掃描技術對各類生物分子異構(gòu)體具有普遍適用性。如圖3所示，該技術同樣可分辨脂質(zhì)和多肽分子異構(gòu)體。研究工作中，離子云掃描方法展現(xiàn)出多種優(yōu)點，如分析部件結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、具有強大的時間/空間串級質(zhì)譜能力等，可以方便地與多類質(zhì)量分析器聯(lián)用，用于設計混合型串聯(lián)分析質(zhì)譜儀器，在生物分子復雜結(jié)構(gòu)解析上展現(xiàn)出較好的應用前景。

圖3. 脂質(zhì)與多肽異構(gòu)體分析。（a）脂質(zhì)異構(gòu)方式示意圖。各種脂質(zhì)異構(gòu)體的離子云掃描譜圖：（b）sn異構(gòu)、（c）碳碳雙鍵位置異構(gòu)和（d）雙鍵順反異構(gòu)。（e）多肽的不同翻譯后修飾類型及其異構(gòu)方式示意圖。不同翻譯后修飾類型的多肽異構(gòu)體離子云掃描譜圖：（f）甲基化、（g）乙酰化和（h）磷酸化。

本研究由國家自然科學基金項目和清華大學精準醫(yī)學科研項目資助。論文第一作者為清華大學精儀系周曉煜副教授，通訊作者為歐陽證教授，其他作者還包括精儀系博士生王卓凡和范菁津，第一完成單位為清華大學精密儀器系精密測試技術與儀器國家重點實驗室。這項研究也得到了清華大學化學系瑕瑜教授、精儀系馬瀟瀟副教授與張文鵬助理教授的大力幫助。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-37281-7